基因技术在治疗视网膜疾病方面的研究与探索

　白癜风能不能彻底治好 https://m-mip.39.net/nk/mipso_4586634.html

之前，我们已经介绍了“干细胞移植”这一技术在治疗视网膜疾病方面的现状与前景。该文发布后，获得大家广泛好评。于是我们再接再厉，将视网膜疾病治疗的另一个重磅武器——“基因治疗”的技术进行详细阐述，普及知识，希望可以帮助到大家，一解心中疑惑。

该论文刊登于《国际分子科学杂志》第20(22)期

论文作者：LuciaZiccardi,VivianaCordeddu,LuciaGaddini,AndreaMatteucci,MariacristinaParravano,FiorellaMalchiodi-Albedi,andMonicaVarano

翻译/整理：Quaker

摘要

遗传性视网膜营养不良（IRD）是一组临床和遗传上异质性变性疾病。迄今为止，突变已与多个疾病基因中的IRD相关，这其中包含了RP、LCA、CHM、Usher综合症、Stargardt、色盲、X连锁视网膜劈裂症等。在过去的十年中，我们目睹了基因测序技术的突破和发展，该技术不仅仅在诊断和预后方面，在确定新的治疗方向以及相关实质性药物研发方面，都代表了医学界的一个全新转折点。IRD的新疾病基因和致病机制的发现为基因治疗方法奠定了基础，多项临床试验正在进行中。“Luxturna”是第一款用于Leber先天性黑朦的基因治疗产品，该产品的投入使用标志着新时代的开始。由于眼睛的解剖学和功能特性，视网膜是基因治疗的首选器官，尽管从临床前的动物模型到人类的转化方法存在很多困难。但其治疗方案依然具备潜力。

在本综述的第一部分中，讨论了有关当前知识概述以及应用于IRD的基因治疗的未来前景；在第二部分中，说明了有关IRD中基因治疗方法的临床试验的最新状态。

关键词：遗传性视网膜疾病，视网膜基因增强，编辑，光遗传学和剪接调节疗法，人iPSC衍生的视网膜和视网膜色素上皮，视网膜病理学，临床前和临床基因治疗，视网膜营养不良的动物模型，视网膜成像

1.简介

神经视网膜是位于眼睛后部的感光膜，具有特殊的感官特性，能够通过感光器捕获光，通过光转导过程将其转换为电信号，并将电脉冲进一步整合和处理为神经元。在中枢神经系统（CNS）形成图像。视网膜可以被认为是中枢神经系统的延伸。换句话说，视网膜是通往大脑的窗口，是研究神经退行性变性的独特且容易接近的部位。

视网膜具有良好的组织架构，并且分层明确。视网膜色素上皮（RPE）在支持感光细胞的代谢中起着至关重要的作用。这些形成外部视网膜的光敏细胞分别根据其在明亮或昏暗的光线下更活跃的能力而分为视锥细胞和视杆细胞。在此水平上，发生光转导，并且光被转换成电信号，该电信号传输到双极细胞的突触末端。这些被包围在内部视网膜中的神经元，是其视网膜神经节细胞（RGC）的真正连接元件，其纤维形成视神经。在神经感觉视网膜的背景下，其他元素，例如无长突细胞，水平细胞和Müller细胞，也参与了视网膜的生化回路和结构。

(插图：光学显微镜下的视网膜结构)

这些照片突出了其组织学复杂性，并证明了不同细胞群体之间的联系。

（A）用差动干涉对比显微镜拍摄的大鼠视网膜组织切片，突出视网膜层。

（B）突触素（Syn）阳性点修饰IPL，表明存在突触。呈红色，呈细胞性视黄醛结合蛋白（CRALBP）阳性的Müller胶质细胞，横跨所有视网膜层。

（C）视网膜内层的GABA能神经元（GABA）。

（D对角线横截面显示波形蛋白阳性的Müller胶质细胞和GABA能神经元之间的丰富联系。细胞核用DAPI染成蓝色。PROS=感光体，外部；PRIS=感光体，内部片段；GCL=神经节细胞层；OPL=外丛状层;ONL=外核层；IPL=内部丛状层；INL=内核层。比例尺=20μm。

由于其良好的解剖学和免疫学特性，眼睛一直处于遗传性视网膜营养不良（IRDs）转化基因治疗的最前沿，而遗传性视网膜营养不良是由缺乏参与视网膜细胞结构的特定基因编码的正常蛋白质导致的进行性变性疾病。

应用基因疗法治疗IRD的优势在于

（1）利用创新的非侵入性技术实现成像和手术的可及性；

（2）视网膜很小，仅需要使用少量的治疗剂；

（3）由于存在血视网膜屏障以及缺乏淋巴管，眼部具备免疫特权，尽管这个问题仍存在一些争议；

（4）在治疗时可进行双眼中单独一侧眼球治疗，并将未治疗的眼睛作为治疗效果和安全性的理想对照的可能性；

（5）可以使用多种动物模型来测试实验性疗法。例如通过改造的小鼠模拟出各种相关基因突变引起的视网膜疾病，开展治疗试验。更可以模拟出各种程度的病程，此点尤为重要，治疗的成功取决于治疗时视网膜变性的水平，因为神经元细胞一旦退化就不能被替换。

目前，从正在进行的临床试验的安全性研究中获悉，在口服类固醇作为预防性措施的情况下，人体可以很好地对基因治疗的相关病毒载体具备耐受性。

在用于基因治疗的药物的递送中，已经考虑了两种主要的给药方式：“视网膜下腔注射”和“玻璃体内注射”。视网膜下注射更具侵入性，旨在更精确地将药物送达RPE和感光体区域。视网膜下腔需要非常靠近中央凹，需要小心控制以防止黄斑裂孔和视网膜脱离。玻璃体内注射更容易进行且风险更低，并且被认为更好地针对了邻近玻璃体腔的内部视网膜。然而，由于该试剂可能会更广泛地全身扩散，因此该方法更可能引起免疫反应。

2.遗传性视网膜营养不良（IRD）

IRD，也称为视网膜变性或营养不良，是一大类遗传性眼疾，导致不可逆的视力丧失和失明。它们的发生是由于一种或多种基因的突变导致视网膜感光细胞死亡而引起的。IRD是神经退行性病变，即使在相同的受影响家庭成员中也有广泛的表现，并且在遗传上是异质的。此外，疾病的进展速度和严重程度在不同的IRD之间以及具有相同视网膜营养不良的不同患者之间表现出很大的差异。这些退化性疾病与眼睛发育，光感受器存活，光转导机制，类视色素周期，视网膜酶功能或细胞结构有关的大约种不同基因的突变是造成这些退行性疾病的原因。遗传模式可以是常染色体显性，隐性，X连锁或线粒体。

疾病的发作可能从出生到幼儿，青春期或成年期有所不同。甚至与年龄有关的变性也可能具有类似于晚发IRD的某些表型。

区分视网膜营养不良形式的常见分类是基于特定细胞成分（视杆，视锥或RPE，以及内部视网膜的两者）的主要影响或视网膜的中央或周围影响，从而将黄斑病变与视网膜病变区分开。

IRD患者的视力显着和逐步受损，可以进行视敏度测量，视野评估，视网膜电图记录（ERG），自发荧光的结构成像，光谱域光学相干断层扫描（OCT）和OCT血管造影。

尽管通过这些创新的非侵入性工具可以实现准确的临床诊断，但是必须进行基因检测以确认特定的表型，并且通过家族隔离分析可以更精确地解决遗传模式。一些IRD是单基因或双基因的，但是在某些情况下，同一基因可以编码不同的表型。例如，已显示PROM1基因的突变会导致色素性视网膜炎（RP），但也会导致Stargardt病；此外，比较特殊的是ABCA4患者所存在的广泛疾病视网膜病变，包含了从Stargardt病/眼底黄斑变性，到视锥细胞营养不良以及RP。这种极端的遗传异质性会导致基因检测出现约30%的失败率（准确率）。实际上，尽管可以做出出色而独特的临床精确诊断，但在三分之一的IRD中仍缺乏基因确认。为了满足基因诊断的重要需求并扩大致病突变的检测率，从单基因DNA测序（使用Sanger技术）为起点，已经开始不断探索新的诊断途径：基因组测序（由下一代测序整个外显子组的（NGS））（通过全基因组测序（WES））到调查整个基因组（通过全基因组测序（WGS））。这种创新技术在基因实验室之间的传播肯定会提高IRD的诊断潜力。

由于IRD的异质表达，临床现象诊断和基因诊断的一致性是保证准确确诊和提供有效治疗的必要目标。遗传变异的精确识别还使有机会向先证者的家庭成员告知该疾病复发的风险，从而允许在年轻的家庭成员中进行症状前诊断，并在疾病发生时帮助识别相关的症状，以及提前预防性治疗。

随着研究整个外显子组或基因组的可能性，为基因诊断打开了更广阔的窗口。目前，基因研究人员与生物信息学密切合作，致力于发现与疾病相关的新基因，揭示已知基因的非编码突变，并实施检测远距离启动子/增强子区域重排和变异，拷贝数变异（CNV），和受IRD影响的患者的结构变异（SV）。这项研究还可以提高识别潜在病原性突变和解决不确定重要性（VUSs）变异的能力。

3.基因传递系统

近年来，已经评估了多种病毒和非病毒载体在受视网膜变性影响最大的细胞，即RPE和感光细胞中的转导功效。

基因治疗的成功取决于载体的选择（表格1）。视网膜营养不良需要永久校正，因此需要尽可能的延长并具有低免疫性的转基因模式。

(插入：表格1)

不整合到宿主基因组中的载体是最佳选择，因为整合可能在插入诱变后引起不良事件。基因转移载体的其他所需特征包括细胞特异性，其中仅靶细胞被转导，具有大的或无限的克隆能力，缺乏毒性，以及以高滴度和高纯度生产的可行性。

3.1。病毒载体3.1.1。腺病毒

腺病毒是基因治疗载体中最常用的一种，这是由于腺病毒能够成功地转导到大量细胞类型中，以及获得独立于细胞周期阶段的高水平转基因表达的能力。但是，通过腺病毒载体进行光感受器的转导很差，除了在细胞类型的发育阶段，例如在新生小鼠中或在变性过程中，如在成年rds小鼠模型中。这很可能是由于正常成年小鼠视网膜的构象和结构，可作为病毒载体介导的基因转移的障碍。

腺病毒载体似乎更适合于治疗RPE缺陷。研究表明（美国国家科学院学报，年10月23日；98（22）：-9），在治疗后1个月内，用rAd注射的RCS大鼠中表达MERTK基因的区域的光感受器功能和数量均有改善。

与其他载体相比，腺病毒载体具有能够携带高达48kb的非常大的插入片段的优势，但是由于它们在安全性和缺乏表达寿命方面存在局限性转。这使得腺病毒载体不适合作为长期转基因表达的载体。为了使腺病毒载体更安全和更有效的，一些研究人员已经尝试掺入较少的病毒基因到重组病毒粒子。

3.1.2。慢病毒（LVs）

LVs是具有逆转录酶的逆转录病毒家族的RNA病毒，通过它们它们能够将逆转录的原病毒DNA整合到宿主细胞的染色体中。在IRD中，已经测试了1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）或马传染性贫血病毒（EIAV）的逆转录病毒变体。逆转录病毒只有在细胞分裂过程中核膜溶解时才能够感染分裂的细胞，这使其不适用于有丝分裂后的组织，例如视网膜。LVs有效地将其基因组整合到宿主细胞的基因组中，从而导致稳定的表达（表格1）。然而，这增加了插入突变的危险，并已导致具有相当的转导效率和持续为能够转导非分裂细胞。通过在整合酶基因中引入点突变使这些载体缺乏整合。在有丝分裂后的组织中，例如RPE，使用非整合型慢病毒载体在体内证明了有效且持续的转基因表达，其表达水平与其有效的整合体相当。对LVs进行修饰以停止复制，因此这些载体在最初的基因递送后不会致病，并整合了可促进其临床应用的其他安全功能。LVs的转基因能力为8-10kb，就IRD而言，它们能够感染RPE细胞，并在较小程度上感染分化的感光细胞。

EIAVs已用于ABCA4，作为其的cDNA（6.8kb的）的大小outplaces的AAV的载货能力。为了评估人类受试者的这一策略，一项临床试验（编者扩展信息：赛诺菲SAR项目，试验编号：NCT）已经进行了数年（表2），但尚未报告明确的疗效数据。到目前为止，在人眼中使用慢病毒载体进行基因治疗似乎仅限于RPE中的基因校正，因为这是为治疗目的而高效转导的唯一细胞类型。慢病毒载体可以通过介导的分泌的因子，如神经营养或抗凋亡因子的递送是感光体的缺陷的治疗中是有用的。

（插入：表格2治疗遗传性视网膜营养不良的主要临床前模型）

3.1.3。腺相关病毒（AAV）

在用于基因治疗视网膜疾病的所有载体中，在基因转移的效率和稳定性前提下，基于AAV的载体代表了治疗许多IRD的最有前途的方法。多种特性使其适合视网膜基因治疗，例如缺乏致病性，最小的免疫原性，转导不分裂细胞的能力以及介导治疗基因表达持续水平的能力（表格1）。但主要问题以其有限的包装能力为代表，这使其无法用于治疗由编码序列超过5kb的基因突变引起的IRD。因此，近年来，针对提高AAV载体转移能力的方案正在努力进行中。

腺相关病毒是最小的病毒，衣壳约为22nm。由于它们需要存在辅助病毒才能进行复制，因此腺相关病毒被归类为天生病毒。迄今为止，从不同动物物种中分离出超过种AAV血清。血清的衣壳蛋白序列不同，用于基因治疗的AAV重组载体（rAAV）主要基于2型血清型（AAV2）。这是人类血清第一个特征最鲜明的AAV血清型。由于AAV衣壳蛋白负责其向性并因此决定其功效，因此开发了一种伪型策略，其中伪型或杂型AAV载体编码血清型rep（通常为AAV2）和另一种血清型的cap基因。

除伪型外，已采用其他设计定制衣壳的策略来进一步扩展AAV载体的实用性。这些包括产生嵌合衣壳（由不同血清型的衣壳亚基的混合物组成）或嵌合衣壳（包含已被结构域或在血清型之间进行氨基酸修饰或交换的衣壳蛋白）。最近，在调节AAV向性的技术研发方面，已有很大突破。

它们已广泛的被用于从莱伯先天性黑蒙（LCA）、RP、葡萄膜炎和血管型视网膜疾病的治疗的动物模型试验中。与此同时它们也已经用于临床试验中以治疗LCA。

3.2。非病毒基因转移

尽管各种病毒载体已经显示出它们在IRDs治疗中的潜力，但是仍然需要改进递送载体。因此，研究工作也一直致力于开发非病毒传递系统，例如纳米颗粒（NPs）（编者扩展信息：相关知识点可查阅我们“青少年黄斑变性患者交流自救之家”

转载请注明：http://www.sohubb.com/lctx/7973.html