细胞系构建人类视网膜色素上皮细胞系H

JournalofCellularPhysiology（IF=4.）刊载了伊朗国家基因工程与生物技术研究所ZAHRA-SOHEILASOHEILI教授团队发表的Isolation,CharacterizationandEstablishmentofSpontaneouslyImmortalizedCellLineHRPE-2SwithStemCellProperties（DOI:10./jcp.）的研究论文，该研究探究了人类视网膜色素上皮细胞系HRPE-2S的分离、鉴定和构建，并利用免疫细胞化学测定、确定HRPE-2S的详细特征(如倍增时间、有丝分裂指数、蛋白质表达和LDH同工酶电泳图谱)、菌落形成效率、细胞活力。研究的目的介绍新型RPE细胞系（HRPE-2S），并将该细胞系用于未来研究和改善传统性眼病的有效治疗策略中。

RPE是高度特异化的六边形单层细胞，位于神经视网膜和脉络膜之间。其主要功能是从脉络膜输送营养、形成血视网膜屏障、感光器外节膜的吞噬作用和散射光的吸收。RPE细胞功能异常会导致视力障碍，例如与年龄相关的黄斑变性、色素性视网膜炎、视锥细胞营养不良等疾病。但是这些疾病的研究与治疗仅限于RPE细胞原代培养，在传代培养中存在诸多问题，如与体内细胞不完全一致（色素的沉着和代谢、基因表达改变等），并且只能存活第八到第十代，由于短期培养的缺点以及缺乏足够的供体眼组织，永生化细胞系是可长期获得的RPE细胞来源，可用于长期观察和研究。

目前已经从原代细胞的连续传代培养构建出了一些细胞系，例如大鼠RPE细胞系（BPEI-1）、小鼠细胞系（B6-RPE07）和人RPE细胞系（D和ARPE-19），而其他细胞系通过癌基因或病毒蛋白转染而被诱导为永生细胞，例如大鼠RPE细胞系RPE-J，其已被SV40病毒转染（Chen等，；Davis等，；Dunn等，；McLaren等，；Nabi等，）。

本文主要介绍了自两天大的男性婴儿供体的原代RPE细胞中自发产生的永生化人类RPE细胞系HRPE-2S的分离和表征。

该研究结果包括以下几个方面：

(1)HRPE-2S细胞系在衰老的原RPE细胞培养中产生：将分离的RPE细胞接种在补充有20％FBS的DMEM/F12中，培养第一周，细胞呈星形或多边形（A），培养第2-6代，细胞形态呈细长梭形(B)，第6代以后细胞开始衰老，呈扁平状(C)，并且观察到有干细胞样的细胞悬浮于培养皿中。

(2)HRPE-2S细胞传近70次:这些细胞没有衰老并显示出持久的形态（图1M-1R），HRPE-2S细胞的传代培养仍然可以长期使用。

（3）细胞生长特征：培养4天后，细胞进入对数生长阶段，通过细胞传代，细胞生长速率更高，倍增时间却更短。相反，原代RPE细胞的增殖潜力降低，并且细胞通过传代而衰老。

（4）HRPE-2S细胞表达上皮细胞标志物：ZO1表达代表培养物中单层上皮细胞的特殊特征：细胞之间上皮紧密连接的形成，ICC分析证实了ZO1在第9和第56代中的细胞表达（图G，3H，3J，3K），且细胞没有通过传代而失去该特性。

（5）HRPE-2S细胞表达共同的细胞增殖标志物：Ki-67是一种核蛋白，与细胞增殖密切相关。在间期，可以在细胞核内检测到Ki-67抗原，而在有丝分裂中，大多数蛋白质被重新定位在染色体表面。ICC分析表明，所有HRPE-2S细胞系在第9和第56代中均表达Ki-67（图3M，3N，3P，3Q），说明HRPE-2S细胞系未因传代而失去细胞增殖潜能。

(6)HRPE-2S细胞表达具有干细胞标记：对PAX6，CHX10和Nestin蛋白表达水平的分析表明，HRPE-2S细胞表达了这些视网膜干细胞标记，而原代RPE细胞仅表现出中间丝状蛋白的胞质表达（图4A-4P）。

(7)菌落形成效率（CFE）：菌落的数量决定了培养物中细胞的克隆形成潜力（YamaguchiandCondeelis，），它通常用于基于干细胞在体外的自我更新能力来鉴定干细胞。HRPE-2S细胞代表圆形堆积的菌落（图5A-5D），而原代RPE细胞形成密度较弱的菌落（图5E-5H）。HRPE-2S细胞系在第16、21、30、41和第53次传代的菌落形成效率平均为84.6％±1.4、85.3％±1.4、87.5％±1.5、84.3％±5.8、85.6％±0.88（图5I和5K），而原RPE细胞在第4、5和6次传代中菌落形成效率只有13％±4、14％±5.1和12.5％±0.5的（图5J和5L）。HRPE-2S细胞和原代RPE细胞的CFE在不同传代中没有显示显着差异，此结果用了三个独立实验来证实。

(8)刮擦伤口愈合测定：刮擦测定是一种模拟体内细胞迁移的成熟方法。先前的结果表明，伤口的愈合潜力高度取决于体内干细胞的再生能力（Castilho等人，）。划伤后HRPE-2S细胞在24h（P=0.03），48h（P=0.05）和72h（P=0.）比之前原RPE细胞具有更快的运动能力。

(9)入侵测定：该测定法对干细胞的侵袭能力进行了敏感测试，以实现其在再生医学治疗中的临床应用（Rutten等人，）。与原代REP细胞相比，HRPE-2S细胞具有更高的侵袭能力（P=0.）。

(10)HRPE-2S细胞的血清独立生长：无血清培养物在维持和扩增干细胞和祖细胞方面有许多应用，研究显示HRPE-2S细胞在无血清、1%FBS和5%FBS这些严苛的条件下也能存活并生长。

(11)模拟缺氧条件对HRPE-2S细胞系和原代RPE细胞培养的影响：该研究表明在低氧条件培养24h后可诱导原RPE细胞死亡，而HRPE-2S细胞系在所有缺氧培养条件下均表现出正常的形态。

Figure.4

(12)HRPE-2S细胞系和原代RPE细胞中LDH同工酶表达的模式：LDH同工酶分析显示LDH-5同工型具有相同且清晰的条带，并证实了HRPE-2S细胞和原代RPE细胞的相同细胞来源。

(13)有丝分裂指数测定：有丝分裂指数是指细胞经历有丝分裂的群体中的数目与细胞总数之比。有丝分裂指数升高表明干细胞培养物中多个自我更新分裂（Egger等，）。HRPE-2S细胞在第9、13、26、34和41代中的有丝分裂指数分别为7.3％±0.5、8.3％±1、8.45％±2、10.73％±1.3和11.86％±1.7（图11）。数据分析表明，传代可增加HRPE-2S细胞的增殖潜能。

在本文中主要介绍了自2天大的男婴供体中分离出的原代RPE细胞自发产生的HRPE-2S细胞系。细胞呈星形或多角形，倍增时间为22h。经SEM显微镜评估，这些细胞表达了RPE细胞、上皮和神经干细胞的特定标记，并形成了神经球样形态；通过天然凝胶电泳和LDH同工酶表达模式分析证实HRPE-2S细胞系和原代RPE细胞来源相同；研究表明HRPE-2S细胞系在体外培养中的克隆形成能力和非锚定生长能力像干细胞一样；迁移和侵袭测定证实了HRPE-S2细胞系的再生能力；这些测定证实了HRPE-2S细胞系的功能性具有干细胞样特性。除此之外，这些细胞像其他的干细胞系一样:表现出高的有丝分裂指数、而且它们可以在低血清甚至无血清或低氧培养等严苛条件下存活并增殖，这些全部特征将证实HRPE-2S细胞为干细胞系。这些细胞将成为有利用价值的体外模型，可用于RPE在基于干细胞的研究中的应用，并为传统性眼病开发有效的治疗策略。

EditedbyBXH

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